Título

AVALIAÇAO DOS EFEITOS MOLECULARES ASSOCIADOS AO GENE PODXL, APOS OVERLOAD DE ALBUMINA EM CULTURA DE PODOCITOS COM E SEM LESAO INDUZIDA POR PUROMICINA.

Introdução

A proteinúria é um importante marcador de prognóstico para doença renal e um dos principais sintomas das podocitopatias. No entanto, ainda existem controvérsias se a exposição prolongada dos podócitos a proteínas no ultrafiltrado glomerular poderiam atuar como coadjuvantes ou mesmo desencadeante de lesão podocitária e quais as consequências moleculares nos podócitos. A podocalixina, codificada pelo gene PODXL, é responsável pela manutenção dos diafragmas de fenda e atua na dinâmica do citoesqueleto de actina. O objetivo desse estudo foi verificar, in vitro, o efeito de concentrações progressivas de albumina, na expressão da podocalixina, em cultura de podócitos com e sem tratamento prévio com puromicina (PA).

Material e Método

Podócitos humanos foram cultivados a 33ºC para proliferação e a 37ºC para diferenciação. Após diferenciação por 10-14 dias, podócitos com e sem tratamento com PA foram expostos a diferentes concentrações (0, 3, 9, 12, 15, 18, 20, 30, 40 mg/ml) de albumina durante 24h. Após extração de RNA total e síntese de cDNA, foi verificada a taxa de transcrito do gene PODXL por Real-Time PCRq utilizando o RPLP0 como controle endógeno. A expressão foi confirmada por imunocitoquímica indireta (ICI). As análises estatísticas foram realizadas com teste ANOVA e teste a posteriori de Turkey com p≤ 0,05, no programa SPSS. Os experimentos foram realizados em duplicada técnica e triplicata biológica.

Resultados

Nas concentrações de 30 e 40 mg/ml (3,0g% e 4,0g%) de albumina, no grupo sem dano, a taxa de transcrito do PODXL foi de 25 e 54 vezes maior, respectivamente, que o controle sem overload de albumina (p<0,0001, n=3). Já nos podócitos com lesão com PA, a partir da concentração de 15 mg/ml, a expressão foi 49, 55, 57, 65 e 68 vezes maior que o controle sem exposição à albumina (p<0,0001, n=3). A análise de ICI apresentou mesmo padrão de aumento de expressão.

Discussão e Conclusões

A maior expressão observada do PODXL, que atua na manutenção do espaçamento do diafragma de fenda e do citoesqueleto de actina, poderia indicar uma defesa, na tentativa de estabilizar o citoesqueleto de actina e manter as condições de filtração. Este é um estudo preliminar in vitro e estudos in vivo são necessários para a aplicação dos resultados.
O overload de albumina nos podócitos com e sem dano com PA alterou a expressão do gene PODXL. Este estudo é um passo inicial para a compreensão dos mecanismos moleculares associados aos danos fisiológicos decorrentes do aumento da concentração de albumina no filtrado glomerular.

Palavras Chave

proteinúria; podócitos; puromicina aminoglicosídeo, albumina