TÍTULO

A remoção condicional do SV40T de hepatócitos humanos primários transformados recupera a expressão seletiva do gene CYP

OBJETIVO

Culturas primárias de hepatócitos humanos sáo comuns em sistemas in vitro para estudar o metabolismo hepático de xenobióticos. No entanto, as fontes de tecidos humanos saudáveis como doadores de hepatócitos sáo muito limitados. No presente estudo, objetivamos desenvolver um sistema reversível para facilitar a auto-regeneraçáo dos hepatócitos primários, mantendo a capacidade de restauraçáo da funçáo diferenciada. Nossa hipótese foi que a remoçáo temporal dos SV40T dos hepatócitos transformado renovava a expressáo de funções metabólicas altamente especializadas.

MÉTODO

Foram gerados retrovírus recombinantes com LoxP-ladeado SV40T sinalizados com EGFP (RetroSV40T) e adenovírus com a expressáo de Cre-recombinase sinalizadas com DsRed (AdCreDsRed). Os vírus foram usados seqüencialmente para condicionalmente transformar hepatócitos murinos e humanos in vitro.

RESULTADOS

A infecçáo com RetroSV40T transformou tanto hepatócitos murinos quanto humanos. A expressáo de EGFP facilitou a monitorizaçáo das células infectadas e isolamento de clones de células transformadas. A expressáo de SV40T resultou em uma reduçáo generalizada na expressáo dos genes CYP por clones transformados de hepatócitos humanos. A infecçáo de um desses clones com AdCreDsRed excisou SV40T e EGFP e expressou eficientemente DsRed para identificar células em reversáo. A análise da expressáo gênica em células infectadas com os adenovírus revelou plena restauraçáo da expressáo de CYP3A4 RNAm e recuperaçáo da expressáo parcial de CYP2C9 e CYP2D6.

CONCLUSÕES

A infecçáo sequencial dos hepatócitos primários com RetroSV40T e AdCreDsRed gera células com capacidade de auto-regeneraçáo, com o potencial para restaurar a expressáo gênica diferencial sobre a excisáo de SV40T pela Cre-recombinase.